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Biophysik: Ein neues Werkzeug für die Nanospektroskopie

Biophysiker an der LMU haben eine monovalente Streptavidin Variante etabliert, die als stöchiometrischer, mechanisch belastbarer Bindungspartner für Einzelmolekülexperimente an Strep-tag II modifizierten Proteinen dient.

Biotin und Avidin sind Schlüsselmoleküle der Nanobiotechnologie. Sie binden mit außergewöhnlich hoher Affinität aneinander und haben sich auch wegen ihrer Robustheit als unabdingbare Agenzien in der Biochemie, Immunologie und Biotechnologie etabliert. Die Vielseitigkeit der Anwendungen wird aber geschmälert durch die Tatsache, dass Biotin nicht natürlich als Ankerpunkt in Nukleinsäuren und Proteinen vorkommt, sondern eine Modifikation der zu untersuchenden Biomoleküle erforderlich ist. Eine Alternative stellt Strep-Tactin dar, eine Variante von Avidin, die anstelle von Biotin auch ein kurzes Peptid (Strep-tag II) mit einer spezifischen Sequenz von acht Aminosäuren binden kann. Ursprünglich wurde dieses System für die Affinitätsreinigung von Proteinen entwickelt, die direkt bei der Biosynthese mit dem Strep-tag II fusioniert werden, da dieser co-exprimierbar ist.

Für Einzelmolekülanwendungen stellt die Tetravalenz des Strep-Tactins, das wie Avidin oder auch Streptavidin eine tetramere Struktur aufweist, ein weiteres Hindernis dar. Ein Forscherteam um Dr. Diana Pippig und Prof. Hermann Gaub am Lehrstuhl für angewandte Physik an der LMU hat jetzt ein monovalentes Strep-Tactin entwickelt, das mit nur einer Bindungsstelle für das Strep-tag II Peptid als stöchiometrischer Bindungspartner in Einzelmolekülstudien dient. Die Affinität zum Peptid-tag ist dabei unverändert im Vergleich zum tetravalenten Konstrukt. Monovalentes Strep-Tactin konnte erfolgreich in Rasterkraftmikroskop-basierte Kraftspektroskopieexperimente zur Entfaltung einzelner Proteine implementiert werden. Dabei wurde die Bindungskraft zwischen Strep-tag II und monovalentem Strep-Tactin charakterisiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass dieses Handgriffpaar ein hervorragendes Werkzeug für weiterführende Kraftspektroskopiestudien z.B. an kraftsensorischen Proteinen darstellt.

Obgleich die Affinititäten zwischen Biotin:Streptavidin (Kd ~fM) und Strep-tag II:Strep-Tactin (Kd ~μM) stark variieren, liegen die Bindungskräfte in einem vergleichbaren Bereich. Mit bis zu 200 pN Abrisskraft, die im Rahmen der experimentellen Gegebenheiten gemessen wurden, ist die Strep-tag II:Strep-Tactin Interaktion sehr robust und damit um ein vielfaches stärker als z.B. die Wechselwirkung zwischen einem Antikörper und seinem Antigen (~40 pN). Interessanterweise konnten Unterschiede in den Abrisskräften beobachtet werden, je nachdem ob der Strep-tag II am N- oder C-Terminus des zu entfaltenden Proteins vorlag. Dies verdeutlicht wie wichtig die Zuggeometrie in der Einzelmolekül-Kraftspektroskopie ist. Grundsätzlich ist es erstrebenswert, so viel Kontrolle wie möglich über die Anbindung und Ausrichtung der Moleküle im Messsystem zu haben, um die Datenausbeute zu erhöhen und um die Daten besser einordnen und analysieren zu können. Mit dem neu etablierten Handgriffsystem ist dies nun sehr effizient gelungen. Durch eine Steigerung der Datenausbeute eröffnen sich neue Möglichkeiten, kraftsensorische Proteine unter unterschiedlichen Pufferbedingungen, in Gegenwart von Substraten oder Liganden, jedoch in einem reproduzierbaren experimentellen Aufbau und statistisch aussagekräftig zu charakterisieren. Die Effizienz des Systems ermöglicht es auch, komplexere biophysikalische Fragestellungen zu untersuchen, indem beispielsweise kombinierte Messaufbauten aus Fluoreszenz- und Rasterkraftmikroskop verwendet werden können.

Die Konzeption des monovalenten Strep-Tactins bietet weiterhin einen einzelnen Cystein-Rest auf der Gegenseite der Bindungsstelle in der aktiven Untereinheit im Tetramer, der der spezifischen Immobilisierung des Moleküls z.B. am AFM-Cantilever dient, aber ebenso genutzt werden kann, um das Konstrukt mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren. Damit eröffnen sich weitere Möglichkeiten der Anwendung des monovalenten Strep-Tactins zur Detektion Strep-tag II modifizierter Proteine.

Zusammenfassend wurde mit monovalentem Strep-Tactin ein neues molekulares Werkzeug etabliert, das in verschiedenen Bereichen der Nanobiotechnologie und Spektroskopie Anwendung finden wird.

Baumann et al., Nature Nanotechnology